細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征之一，在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V是一種分子量為35.8KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡過(guò)程中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）高親和力特異結(jié)合。FITC-Annexin V結(jié)合到凋亡細(xì)胞后，在藍(lán)色光的激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光，區(qū)分出凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一種核酸染料，它不能穿透完整細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的破損細(xì)胞膜能夠穿透，并使細(xì)胞核紅染。將FITC-Annexin V與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。 
    
    
    產(chǎn)品特點(diǎn) 
    檢測(cè)快速簡(jiǎn)單，僅需10 分鐘，一次測(cè)試即可； 
    組成為: FITC-Annexin V；結(jié)合緩沖液；碘化丙啶 
    和DNA檢測(cè)方法相比，能夠更早地檢測(cè)到凋亡細(xì)胞。 
    

    操作步驟 
    1. 整待測(cè)細(xì)胞的濃度為5×105-1×106個(gè)/ml。
    2. 取1ml細(xì)胞，1000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清。
    3. 加入1ml冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清（對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用胰酶消化，再用PBS洗滌）。
    4. 重復(fù)步驟3兩次。
    5. 將細(xì)胞重懸于200μl Binding Buffer。
    6. 加入10μl Annexin V-FITC和10μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘 或4℃反應(yīng)30 
    分鐘。
    7. 加入300ul Binding Buffer，在1小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。
    8. 若用熒光顯微鏡檢測(cè)，將細(xì)胞混合液離心，取細(xì)胞沉淀涂片，再進(jìn)行觀察。 
    
    保存條件 
    貯存于 2-8°C。建議Annexin V-FITC打開(kāi)后，分裝成小份凍存于-20°C。 
    
    注意事項(xiàng) 
    為保證得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在使用此試劑盒之前請(qǐng)認(rèn)真閱讀該注意事項(xiàng)。 
    
    旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。 
    Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請(qǐng)注意避光。 
    Propidium iodide（PI）能通過(guò)皮膚吸收，對(duì)眼睛有刺激作用。 
    在細(xì)胞洗滌的zui后一步，請(qǐng)盡量將上清棄凈，以免PBS殘留，有可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 
    PI染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有可能造成檢測(cè)的凋亡率偏高，建議首先進(jìn)行Annexin V-FITC染色，上機(jī)前5分鐘再加入PI染色。 
    整個(gè)操作過(guò)程動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4℃下操作。 
    反應(yīng)完畢后請(qǐng)盡快檢測(cè)，因?yàn)榧?xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，反應(yīng)1小時(shí)后熒光強(qiáng)度就開(kāi)始衰變。 
    成功的檢測(cè)凋亡受以下幾種因素的影響，如細(xì)胞類型、細(xì)胞膜上PS的密度、發(fā)生凋亡時(shí)PS翻轉(zhuǎn)的比例、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法、所用試劑、誘導(dǎo)凋亡的時(shí)間等，把這些影響因素進(jìn)行優(yōu)化對(duì)實(shí)驗(yàn)成功是非常必要的。 
    此試劑盒僅供科研使用。